mikroskop

I det almindelige såkaldt sammensatte lysmikroskop gennemlyses det objekt, man ønsker at studere, præparatet, vha. en kondensor, der koncentrerer lyset i et kegleformet bundt. Spektralsammensætningen bestemmes af lyskilden og eventuelle filtre. Det er vigtigt for billeddannelsen, at en del af lyset er kohærent, dvs. at bølger, der udsendes samtidig fra et punkt på lyskilden, svinger i samme fase. Dette opfyldes ved at anvende en lille højtemperatur-lyskilde, fx en halogenlampe.

Objektet skal være tyndt og gennemskinneligt. Biologisk materiale præpareres ofte som tynde snit, mindre end 10 μm tykke; mineraler o.l. slibes til ganske tynde plader, slibesnit. Objektet påvirker lyset på flere måder: ved diffraktion (brydning eller afbøjning), faseforskydninger, ændring af spektralsammensætningen og evt. polarisation, således at lyset efter passagen medbringer information om objektets struktur og visse materialeegenskaber.

Ved efterbehandling af lyset i et linsesystem, objektivet, der virker som en stærk samlelinse, frembringes et forstørret billede af objektet, kaldet mellembilledet, som kan betragtes direkte med øjet gennem endnu et forstørrende linsesystem, okularet, eller optages med et kamera.

I et binokulært mikroskop deles lyset fra mellembilledet vha. et prismesystem ligeligt til to okularer, således at to ens billeder ses med hvert sit øje; dette er mindre anstrengende for synet. Et stereomikroskop eller en stereolup er sammensat af to monokulære mikroskoper, hvis akser konvergerer med en lille vinkel mod præparatet. Objektet ses derfor samtidig med de to øjne fra to lidt forskellige vinkler, hvorved billedet får rumlig dybde. Stereomikroskoper konstrueres med stor arbejdsafstand (afstanden mellem objektiv og objekt). Opløsning og forstørrelse er moderate, ofte op til 60-100 gange, men tilstrækkelige som hjælp ved manuelt arbejde med små objekter, fx i mikrokirurgi, elektronik og finmekanik.

Objektivet er i de fleste mikroskoper anbragt over objektet, og kondensoren under. I et omvendt mikroskop betragtes objektet nedefra, hvilket er praktisk ved mikroskopi af objekter, der ligger i en væske i en lille skål, fx en cellekultur.

Grundlæggende for billeddannelsen er lysets diffraktion i objektet, der virker som et kompliceret optisk gitter, dvs. de enkelte strukturelementer afbøjer lyset mere, jo tættere de ligger. For at afbilde (opløse) to tætliggende strukturelementer som adskilte billedpunkter kræves, at såvel brudt som ubrudt lys fra hvert element vha. objektivet bringes til at mødes (fokuseres) i hvert sit punkt i billedplanet, hvor lyset interfererer, konstruktivt eller destruktivt, afhængigt af faseforskellen mellem de lysbølger, der mødes.

Objektivets opløsningsevne er således diffraktionsbegrænset, dvs. afhængig af dets evne til at indfange det lys, hvis udbredelsesretning er blevet ændret (brudt) af objektet. Denne evne udtrykkes ved objektivets numeriske apertur. Den teoretisk højeste opløsning, et lysmikroskop kan præstere med synligt lys, er knap 0,2 μm, og dette opnås ved brug af kortbølget (violet) lys, samtidig med at det snævre mellemrum mellem objekt og objektiv fyldes med en olie, der har nogenlunde samme høje brydningsindeks som glas (olieimmersion); derudover kræves, at præparatet er ganske tyndt, ca. 1 μm. De stærkeste, almindeligt anvendte objektiver forstørrer 100 gange, og mikroskopets samlede forstørrelse gives ved produktet af objektivets og okularets forstørrelser: på mange mikroskoper op til 1000 gange.

I ultravioletmikroskopet opnås en noget højere opløsning, ca. 0,1 μm, pga. lysets kortere bølgelængde, men linserne skal fremstilles af specielle glassorter, og billedet må registreres med et kamera, da ultraviolet lys ikke opfattes af øjet. Infrarødmikroskopet udnytter, at visse materialer, der er uigennemtrængelige for synligt lys, er gennemtrængelige for infrarødt lys, men oftest må billedet registreres med et kamera.

I mørkefeltmikroskopet er kondensoren konstrueret således, at præparatet belyses under en så flad vinkel, at det ubrudte lys passerer forbi objektivet, således at kun lys afbøjet af præparatet indfanges i objektivet. Strukturelementerne fremtræder herved som selvlysende objekter på en sort baggrund. Strukturer, der er mindre end objektivets opløsningsevne, kan således synliggøres, men de afbildes relativt større, end de er, og kan ikke opløses som adskilte strukturer, hvis de ligger tættere end objektivets opløsningsevne.

En farvet objektdetalje virker som et optisk filter, der kun tillader passage af lys af bestemte bølgelængder, og vil derfor billeddannes med disses farver. Dette udnyttes bl.a. ved undersøgelser af celler og væv, og hertil er udviklet et stort antal farvemetoder, der selektivt farver forskellige komponenter i præparatet, se histokemi og histologi.

Lys, der passerer en strukturdetalje, som har større brydningsindeks eller er tykkere end omgivelserne, bliver relativt forsinket. Denne forsinkelse andrager i biologiske præparater typisk ca. ¹/₄ bølgelængde. Dette forhold udnyttes i fasekontrastmikroskopet, hvori præparatet belyses gennem en ringformet blænde. I objektivets bageste brændplan, hvor det brudte og det ubrudte lys er rumligt adskilt, er indlagt en tilsvarende ringformet faseplade, som forsinker det ubrudte lys yderligere ¹/₄ bølgelængde i forhold til det brudte. Det brudte og det ubrudte lys er således ved mødet i billedplanet faseforskudt omkring ²/₄ bølgelængde og interfererer derfor destruktivt, således at strukturen afbildes mørk på lys baggrund.

I differential interferenskontrastmikroskopet opnås en lignende virkning ved at lade lyset i kondensoren passere et særligt prisme, der deler en lysstråle i to ganske tætliggende, men adskilte og modsat polariserede stråler. I objektivet er indsat et tilsvarende prisme, der genforener de to stråler. Hvis disse på deres vej gennem objektet har passeret på hver side af en grænseflade mellem strukturelementer med forskelligt brydningsindeks og derfor er blevet indbyrdes faseforskudt, vil de ved genforeningen enten svække eller forstærke hinanden ved interferens. Fasekontrast- og interferenskontrastmikroskoper finder stor anvendelse i biologien, fordi de tillader direkte studier af levende celler.

I fluorescensmikroskopet, der ligeledes finder udstrakt anvendelse i biologiske studier, udnyttes den egenskab ved en række farvestoffer, at de fluorescerer, dvs. at de ved belysning (excitation) med lys af en bestemt bølgelængde udsender (emitterer) lys med en anden (altid længere) bølgelængde, der er præcist defineret af farvestoffet. I moderne fluorescensmikroskoper belyses det farvede præparat gennem objektivet vha. et skråtstillet spejl, der har den egenskab, at det reflekterer det kortbølgede, exciterende lys, som kastes ind fra siden, men lader det lys passere, der ved fluorescens emitteres fra præparatet, mens det exciterende lys reflekteret fra præparatet spejles ud af strålegangen. Ved fluorescensmikroskopi fremtræder objektet som selvlysende. Det er derfor muligt, ligesom i mørkefeltmikroskopet, at synliggøre strukturer, hvis størrelse er langt under mikroskopets opløsningsevne.

I polarisationsmikroskopet undersøges vha. en polarisator anbragt under kondensoren og en anden polarisator (analysatoren) anbragt under okularet, om strukturer i objektet har egenskaber, der påvirker lysets polarisationsretning. Polarisationsmikroskopet finder især anvendelse i mineralogi og ved tekniske materialeundersøgelser.

I det konfokale laserscanningmikroskop (CLSM) udnyttes det forhold, at lys fra en punktformet lyskilde af objektivet kan fokuseres i et præcist defineret plan i præparatet, og at lys udsendt herfra ved fluorescens eller refleksion med objektivet og en hjælpelinse kan fokuseres i et tilsvarende præcist defineret såkaldt konfokalt plan, mens lys udsendt fra andre niveauer i præparatet fokuseres i andre planer. En ganske snæver blænde anbragt i det konfokale plan tillader derfor kun passage af lys fra et bestemt niveau i præparatet. Ved at bevæge lyskilden systematisk (dvs. scanne) fås en tilsvarende scanning af præparatets punktbelysning. Lys fra et punkt i det definerede plan i præparatet registreres af en detektor og afbildes som et billedelement (en pixel) på en digitalskærm. Ved anvendelse af specielle spejle og filtre kan lys udsendt samtidig fra forskellige fluorescensfarver i det samme præparat adskilles og registreres i hver sin detektor og afbildes simultant i digitalbilledet. Ved systematisk at ændre præparatets afstand fra objektivet kan der optages en serie billeder, der hver repræsenterer et optisk snitplan i præparatet. CLSM har fået en vigtig plads i biologien, dels fordi det tillader simultan billeddannelse af forskellige strukturer, der er selektivt mærkede med forskellige fluorescensfarver, dels fordi det muliggør afbildning med høj opløsning i optiske snit af tykkere præparater, fx hele celler.

Opfindelsen af det sammensatte lysmikroskop dateres til omkring 1590 og tilskrives den hollandske brillemager Hans Janssen og hans søn Zacharias. Det bestod af to samlelinser indfattet i forskydelige rør. Forstørrelsen var beskeden, knap ti gange. Lignende mikroskoper blev omkring 1610 bygget og beskrevet af Galilei.

Anvendelsen af en enkelt samlelinse som forstørrelsesglas havde længe været kendt og blev perfektioneret i de såkaldt simple mikroskoper, der i en lang periode var de sammensatte mikroskoper overlegne mht. opløsningsevne (se fx A. van Leeuwenhoek). Det sammensatte mikroskop blev i 1600- og 1700-t. forbedret, navnlig ved ændringer af okularets konstruktion (bl.a. af C. Huygens), belysningen af præparatet samt den mekaniske konstruktion til fokusering og fastholdelse af objektet.

Opløsningsevnen var imidlertid længe stærkt begrænset af linsefejl (især kromatisk og sfærisk aberration). Et stort gennembrud skete omkring 1800 ved konstruktionen af akromatiske objektiver sammensat af linser af forskellige glassorter, der tilsammen delvis ophæver den kromatiske aberration.

Konstruktionen af sammensatte linser, bl.a. til mikroskoper, hvilede til efter midten af 1800-t. i høj grad på instrumentmagernes empiriske viden. En central person i den videre udvikling af lysmikroskopet blev E. Abbe, der i 1866 blev ansat hos Carl Zeiss i Jena. Omkring 1873 opstillede han en komplet teori for billeddannelsen i lysmikroskopet, hvilket muliggjorde rationel optimering gennem beregninger. I samarbejde med glaskemikeren Otto Schott (1851-1935) udviklede han de glassorter, der i 1886 muliggjorde konstruktionen af såkaldt apokromatiske objektiver og kompensationsokularer, hvormed linsefejlene elimineredes, og den teoretiske grænse for mikroskopets opløsning (0,2 μm) blev nået.

Fasekontrastmikroskopet, der var banebrydende for den biologiske forskning, blev opfundet i 1934 af F. Zernike, som udviklede fasekontrastprincippet. Han blev i 1953 belønnet med nobelprisen i fysik for denne opfindelse.