kromatografi

En forudsætning for at kunne analysere et stof ved hjælp af gaskromatografi (GC) er, at stoffet kan bringes på gasform. Dette vil muliggøre, at stoffet kan fordele sig mellem den mobile gasfase (bæregassen) og den stationære fase. I praksis udføres gaskromatografi ved, at den stationære fase, som kan være et fast stof eller en højtkogende væske, placeres i et rør (en kolonne).

Tidligere anvendtes kolonner med indre diameter på 2-4 mm og en længde på 1-6 m, hvori den porøse, pulverformige stationære fase blev pakket. Hvis den stationære fase var en væske, var den fordelt på overfladen af et porøst pulver. Nu anvendes hovedsagelig kapillargaskromatografi, hvor den stationære fase befinder sig i et tyndt lag på indersiden af et tyndt rør — 0,25-0,5 mm i indre diameter. Da røret ikke er fyldt ud med stationær fase, kan der anvendes kolonnelængder på op til flere hundrede meter. Sådanne lange kolonner har en stor separationseffektivitet og anvendes til meget kompliceret sammensatte prøver, fx miljøanalyser. Normalt anvendes dog kolonner med længder på 10-50 m. Som mobil fase (bæregas) anvendes en inert gas, fx nitrogen eller helium, som bærer analytten igennem den termostaterede kolonne frem til en detektor, af hvilke der findes en lang række med forskellige egenskaber. Separationen bestemmes primært af den stationære fases egenskaber og af kolonnens temperatur.

Ved væskekromatografi kan også ikke-flygtige forbindelser separeres, og her er der samtidig flere muligheder for at variere den mobile fases sammensætning og dermed styre separationen. Desuden kan princippet teknisk set udføres på flere forskellige måder. I papirkromatografi og tyndtlagskromatografi (TLC) trænger den mobile fase op gennem den stationære fase, som hhv. er papir eller et pulverformigt adsorptionsmateriale, der er anbragt på en plade af glas, plast eller aluminiumfolie.

I de fleste tilfælde er den stationære fase pakket i en kolonne, hvorigennem den mobile fase pumpes (søjlekromatografi). Der findes mange forskellige typer af stationære faser, og der kommer stadig nye til. Det kan være geler til størrelseskromatografi, hvor molekylerne sorteres efter størrelse; ionbyttere til ionbytningskromatografi, hvor ioner med bestemte ladninger selektivt tilbageholdes; affinitetsmaterialer, som meget selektivt tilbageholder bestemte analytter, eller det kan være mere generelt anvendelige materialer som fx kemisk modificeret kiselgel. Hvis kiselgel på overfladen modificeres med langkædede carbonhydrider, fås et upolært materiale, som ved anvendelse sammen med en polær, vandbaseret mobil fase giver de meget anvendte omvendt-fase-kromatografisystemer. Disse er siden deres opfindelse omkring 1970 blevet uhyre populære på grund af deres store anvendelighed i forbindelse med alle former for bioanalytisk/bioteknologisk arbejde. Ved væskekromatografi bestemmes separationen af såvel den mobile som den stationære fase.

Når en analyse skal udføres, introduceres prøven i det kromatografiske system som et smalt bånd. Den mobile fase fører derefter prøvemolekylerne gennem kolonnen hen over den stationære fase. Stoffer, som adsorberes til eller opløses i den stationære fase, vil blive tilbageholdt. Jo større del, der fastholdes af den stationære fase, desto mere tilbageholdes stoffet. Umiddelbart efter kolonnen passerer stofferne en detektor, og analysen resulterer i et kromatogram, hvor hvert stof, der forlader kolonnen, fremstår som en top.

Kvalitativ analyse udføres bl.a. ved at sammenholde den tid, det tager for et stof at passere kolonnen (retentionstiden), med tiden for en kendt standard. Også Kovats retentionsindeks kan anvendes. En mere sikker identitet kan opnås ved at anvende en detektor baseret på massespektrometri eller kernemagnetisk resonans.

Kvantitativ analyse udføres ved at sammenligne en tophøjde eller et areal med en tilsvarende top for en standard af kendt mængde. I begge tilfælde skal analyserne af prøve og standard udføres under de samme betingelser.

Kromatografi kan også anvendes til fremstilling af rene stoffer (præparativ kromatografi) ved at udføre kromatografien i større skala. Forskellige former for væskekromatografi anvendes bl.a. i lægemiddelindustrien til renfremstilling af bioteknologisk fremstillede stoffer som fx peptider og proteiner.